Tiểu luận Ứng dụng của enzyme trong sản xuất bia

otease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa. Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa. Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin.
2.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động của Protease 
Trong cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. 
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. 
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
- Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. 
Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + p2
. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, 
P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
2.1.3.Nguồn thu nhận Protease 
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống 
Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật
2.2. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật
Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao như các phương pháp sau:
- Phương pháp gây đột biến. 
- Phương pháp biến nạp. 
- Phương pháp tiếp hợp gene. 
- Phương pháp tải.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease
Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. 
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. 
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt 
Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm
Ưu, nhược điểm 
+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme.
+ Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày.
+ Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích
Thu nhận enzyme (E)
Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. 
Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như:
+ Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi.
+ Để tế bào tự phân hủy.
+ Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ.
+ Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp.
Để loại bỏ khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) 
Thẩm tích: trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau.
Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
- Làm đặc 
Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều.
Làm đặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm).
2.3. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae 
Nguyên liệu dd (bột bắp cao nấm men..)
Thu nhận chế phẩm tinh khiết
Chế phẩm enzym
2.3.1. Sơ đồ quy trình thu nhậnTinh chế 
sấy 
Thu nhận kết tủa 
Kết tủa enzym
Thu nhận sinh khối enzym khô
Sấy
Bã (chăn nuôi)
Nghiền mịn
Trích ly
Lọc
Nước 
Khoáng hỗn hợp
Hấp thanh trùng
Làm nguội 300C
Đổ lên khay
Giống ASP.oryzae
Nuôi cấy t0 phòng
Chế phẩm sử dụng 
Chế phẩm enzym đêm tinh chế
2.3.2. Thuyết minh quy trình 
2.3.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào).
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạođã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
2.3.2.2. Kỹ thuyật nuôi cấy
Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2 - 3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
Ø Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Ø Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ. Enzyme protease được tổng hợp mạnh. Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắ