Giáo trình Kỹ thuật DNA tổ hợp

o E.coli
2.1.2.3. Cosmid vector
Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng 40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy chúng có khả năng tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn. Do hầu như toàn bộ phần ADN của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn ADN ngoại lai được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. Phage mang ADN tái tổ hợp không tự nhân lên được vì phần ADN phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường. Cosmid mang đoạn gen lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi giấm, chuột, thậm chí cả ở người.
2.1.2.4. Các vector khác
a) Plasmid Ti: Được sử dụng rộng dãi trong việc chuyển gen ở thực vật. Plasmid Ti bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất, loài Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật
b) Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC: Nấm men là đối tượng quan trọng trong Công nghệ di truyền. Các plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả. Ngược lại plasmid có nguồn gốc nấm men đưa vào tế bào vi khuẩn lại không hoạt động. Cho tới nay ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryota) mới chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất, đó là plasmid hình vòng có kích thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong tế bào nấm men Sacchromyces cerevisiae.
c) Vector là virus của tế bào eukaryote:
	Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, và virus herpes  Các vector nhóm này được sử dụng trong tách dòng gen và chuyển gen ở tế bào động thực vật bậc cao.
	Nhìn chung có nhiểu loại vector khác nhau được dùng trong Công nghệ di truyền. Mỗi loại vector có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn ADN có kích thước khác nhau.
2.1.3 Các loại tế bào chủ
Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụng như:
Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tao dòng. Hệ thống tế bào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.
Dùng để biểu hiện gen, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao như động vật, thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính đặc thù.
Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.
Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một tế bào chủ thích hợp. Các tế bào chủ có thể chia làm hai hệ thống chính, đó là tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ nhân chuẩn.
2.1.3.1. Tế bào chủ nhân sơ
Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E.coli đáp ứng các yêu cầu của tế bào chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen. Do tính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó là cơ sở cho kỹ thuật ADN tái tổ hợp và Công nghệ di truyền.
Vi khuẩn E.coli
Ngoài E.coli một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho các thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomycestuy nhiên những tế bào chủ này có những hạn chế nhất định. Những tế bào chủ này cần đòi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các ADN tái tổ hợp vào chúng gặp nhiều khó khăn.
2.1.3.2. Tế bào chủ nhân chuẩn
	Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E.coli làm tế bào chủ để tách dòng gen vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng nhân bao bọc NST. Do vậy các gen ở sinh vật nhân chuẩn không thể được biểu hiện được trong E.coli vì môi trường khác với môi trường bình thường của sinh vật nhân chuẩn. Như vậy, nếu chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm tách dòng thì khó có thể tin rằng E.coli mang ADN tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein có chức năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn.
Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào phức tạp như động vật, thực vật.
a) Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
Nấm men S.cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5 micromet) dễ nuôi cấy với quy mô lớn, có điểm khởi đầu (promotor) mạnh và có plasmid dùng làm vector YAC biểu hiện gen,  S. cerevisiae có rất nhiều đặc điểm phù hợp để người ta chọn làm tế bào chủ phù hợp nhất.
Ngoài ra các nấm men khác cũng được dùng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm tạo dòng gen như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia pastoris 
b) Tế bào thực vật
Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các phòng thí nghiệm thao tác gen. Tảo đơn bào, ví dụ như loài Chramydomonas rainhardii có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bào thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí nghiệm thao tác di truyền, trong công nghệ di truyền. Tuy nhiên, người ta cũng còn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùng làm tế bào chủ.
c) Các tế bào chủ động vật
Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tế bào chủ động vật. Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:
Tế bào thận của khỉ xanh Châu Phi.
Tế bào thận chuột đồng nhỏ.
Tế bào thận phôi người.
Tế bào tử cung chuột bạch.
Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người.
Tế bào tuyến côn trùng Caenorhabditis elegans.
2.1.4 Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp
Hai yếu tố quan trọng trong công nghệ ADN tái tổ hợp là: khả năng sử dụng các enzym để cắt nối các phân tử ADN invitro và hệ thống các tế bào vật chủ để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với một số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ. Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một dòng tế bào chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen (gene cloning). Một thí nghiệm tách dòng phụ thuộc thuộc vào mục tiêu chủ đạo của thí nghiệm và nguồn nguyên liệu dùng để tách chiết axit nucleic cho việc tách dòng.
2.1.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Tạo nguồn gen
Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen. Có ba loại phương pháp khác nhau để thu nhận gen:
Thu nhận ADN từ hệ gen ( thư viên ADN).
Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học.
Lập ngân hàng ADN bổ trợ (cADN).
b) Tạo plasmid tái tổ hợp
Khi có các đoạn ADN hay cADN mong muốn. Bước tiếp theo là gắn chúng vào vector chuyển gen để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương pháp gắn các đoạn ADN, hoặc cADN vào plasmid, hoặc các vector chuyển gen khác.
Phương pháp dùng đầu dính.
Phương pháp dùng đoạn nối (linkers).
Phương pháp dùng enzym terminal transferase:
2.1.4.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp
Sau khi plasmid tái tổ hợp,hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp theo là biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gen lạ, ví dụ biến nạp vào E.coli. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau
Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất.
Phương pháp xung điện.
Phương pháp vi tiêm.
Phương pháp dùng súng bắn ADN.
Ngoài ra còn một số phương pháp khác đưa ADN vào tế bào chủ...
2.1.4.3 Chọn lọc dòng ADN đặc hiệu và biểu hiện gen
Sau khi biến nạp ADN (gen) vào tế bào chủ nhận thì ở trong tế bào nhận, ADN biến nạp được nhân bản, từ đó chúng tạo ra được dòng ADN (gen). Bước tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gen mong muốn và sau đó tạo điều kiện cho gen biểu hiện.
	a) Chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu
Trong nhiều trường hợp, do sử dụng các loại enzym giới hạn khác nhau nên tạo ra số lượng dòng ADN rất lớn, hoặc một loại enzym giới hạn có thể cắt ra những đoạn gen không mong muốn. Trong khi đó nhà nguyên cứu lại chỉ muốn tách một dòng ADN cụ thể đặc hiệu. Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng ADN là lai axitnucleic dùng mẫu ARN dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm tùy theo tính chất của dòng gen.
b) Biểu hiện của gen mong muốn
Muốn gen đã tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu hiện mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gen ở động vật có vú tạo ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen này trong tế bào E.coli cần lưu ý một số nhân tố sau:
Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần hợp lý.
Phải có khởi điểm (promotor) phiên mã mạnh.
Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã.
ADN tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài trong E.coli.
Không có sự phân giải protein của các enzym trong tế bào chủ.
2.2. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp
2.2.1. Ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp đối với con người
2.2.1.1. Sản xuất vaccine tải tổ hợp
Vaccine được đưa vào cơ thể với mục đích làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch, đặc biệt với các tác nhân gây bệnh si sinh vật. Những vaccine kinh điển được sản xuất dựa trên vi khuẩn, virus đã bị chết hoặc độc lực của chúng bị suy giảm để không gây bệnh. Tuy nhiên, những vaccine kinh điển này vẫn có một tỷ lệ nhỏ tác hại không mong muốn cho người sử dụng. Vì vậy, vaccine thế hệ mới sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để thu nhận vaccine có hoạt tính đặc hiệu cao và đảm bảo an toàn. Công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng vào sản xuất vaccine gồm những bước cơ bản sau:
Đưa gen mã hóa kháng nguyên của vi khuẩn hoặc víu gây bệnh vào vector biểu hiện có promoter mạnh; rồi đưa vector vào tế bào nhận. Tế bào nhận có thể là prokaryot hoặc tế bào động vật nuôi cấy, thu nhận và tinh sạch kháng nguyên từ những tế bào này để sản xuất vaccine.
Gây đột biến, hoặc loại bỏ các gen quy định độc tính của chủng vi khuẩn hoặc virus gây bệnh. Nhờ đó những chủng đột bi